百萤课堂之APC与抗体的缀合实验方案

注1:整个缀合过程可以在内完成。但是，缀合前对apc的纯化可能需要24-48小时。除了下面
列出的材料外，您还需要浓度至少为2mg/ml的抗体溶液。请您在进行apc抗体缀合实验之前熟悉
如何使用脱盐柱以及如何吸光度光谱。
注2:smcc-apc缀合物非常稳定(在“交换缓冲液”中，在4℃下至少可以稳定几个月)。因此，如果您需要节省一部分时间，可以选择同时缀合10毫克或多的apc,并将其用于几次抗体实验(在几周内)。
一.apc的制备
1.将apc纯化。缀合前的浓度通常为5-10mg/ml。
注意：apc在缀合前作为sas(铵钠)沉淀物稳定。如果将apc以sas沉淀物的形式储存，则在使用前进行大量纯化。在用每毫升1升的“透析缓冲液”透析之前，用每毫升1升apc的pbs进行透析2 次。
2.使用1.7毫克apc修饰每毫克lgg, 包括在缓冲液交换过程中损失的额外10%。
3.检查apc的纯度和浓度，请测量280、620和655nm处的吸光度。(1mg/ml的apc在655nm处的od为5.9) 。 655/620比率>1.4表明杂质被充分去除；655/280比率>4表明所有其他蛋白质均已充分去除。
二.apc的活化
1.使用前在无水dmso中制备10mg/ml的smcc储备溶液。
2.每毫克apc加入6μlsmcc,并进行涡旋。将反应管用铝箔包好，室温下旋转60分钟。
3.将纯化的 apc过凝胶过滤柱来交换缓冲液。
注意：对于失败或效果较差的结合，增加或减少smcc相对于apc的量，可能会有所好转。
三.1gg 还原
1.在蒸馏水中制备1m dtt(15.4 mg/100 μl) 的新鲜溶液。
2.1gg溶液浓度应为 4 mg/ml或高，这样效果比较好。还原几乎可以在任何缓冲液中进行；mes 、磷酸盐和 tris 缓冲液(ph 范围为6至8)已被验证可以使用。如果抗体浓度2mg/ml，则应浓缩。缓冲液交换柱上的损失应额外增加10%。
3.用dtt配制20mmlgg溶液：每毫升 igg溶液加入20μldtt 原液并搅拌。室温下静置30分钟，额外搅拌 (以尽量减少半胱酸再氧化为胱酸)。
4.将还原的lgg 通过预平衡的“交换缓冲液”过滤柱。收集0.25毫升的级分，测定蛋白浓度，并将含
有大部分lgg 的级分汇集在一起。可以通过分光光度法或比色法完成。
5.此步骤后尽快进行缀合。
注意：对于结合较差或失败的情况，降低 dtt浓度可能会有所帮助。
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