RNA免疫沉淀RIP实验

rip（rna binding protein immunoprecipitation, rna结合蛋白免疫沉淀）是研究体内 rna 与蛋白结合情况的技术，主要包括rip-qpcr和rip-seq两种；其中rip-qpcr用来验证与目标蛋白结合的已知rna，rip-seq用来筛选与目标蛋白结合的未知rna。
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rna免疫沉淀rip实验原理
细胞裂解后，孵育结合了抗体的珠子，诱饵蛋白通过其抗体结合到beads上，同时和诱饵蛋白互作的rna，也一起沉淀到beads上。洗涤掉未结合的rna后，再用洗脱液将rna-蛋白复合物从beads洗脱下来，便得到rna免疫沉淀产物。rip产物既可用qpcr检测已知rna，也可以二代测序检测未知rna。
当没有合适的诱饵蛋白抗体时，可以通过表达融合了flag标签的诱饵蛋白，利用flag标签做免疫沉淀。即细胞过表达flag-bait，经裂解后与anti-flag珠子孵育，诱饵融合蛋白与beads结合，与诱饵融合蛋白互作的rna“共沉淀”到beads上，再经洗涤、洗脱后做qpcr或ngs测序。
rna免疫沉淀rip实验流程
rip实验，rna结合蛋白免疫共沉淀，rip-seq检测实验.jpg
带标签的rna免疫共沉淀流程图：
rip-qpcr，rip技术实验，rip实验外包.jpg
应用领域
coip技术服务.bmp
rip技术应用背景
rna结合蛋白（rna binding protein，rbp）是一类功能强大而广泛的调节因子，约占细胞编码的所有蛋白的5%~10%。目前除了少数rna以核酶形式单独发挥功能，大部分rna通过与蛋白结合形成rna-蛋白复合物来发挥作用。
一方面，rbp参与rna合成、可变剪接、修饰、转运、翻译及胞内定位等多个转录后调控过程，调控mrna稳定性、lncrna活性、mirna沉默复合体形成等生物学过程；另一方面，rna也会调节这些蛋白质的活性、定位或与其他蛋白质的相互作用，从而影响rbp介导的各种细胞事件。rna与蛋白质的相互作用对于维持细胞稳态是非常重要的，干扰这种相互作用将会导致细胞功能失调和相关疾病的发生。
目前研究rna-蛋白质相互作用的方法分为两大类：一是以感兴趣的rna为中心，寻找与该rna结合的蛋白质；二是以感兴趣的蛋白质为中心，寻找与该蛋白质结合的rna。rip（rna免疫共沉淀）属于后者，利用特异性的抗体捕获样本中的目标蛋白，那么与目标蛋白结合的rna也一并被捕获，之后通过qpcr或者测序技术来确定这些结合的rna。
rna免疫共沉淀rip实验—客户案例
rip（rna免疫共沉淀）研究案例.png
lncrna part1通过plzf介导的ezh2募集导致pdgfb表观遗传沉默来抑制侵袭性胃癌
研究背景
目前的研究显示，一种长链非编码rna(lncrna)“part1”在某些癌症中有抑癌作用，在某些癌症中又有致癌作用。人类胃癌组织的geo芯片数据显示，lncrna part1在胃癌中显著下调，tcga数据库和gepia数据酷信吸显示低水平的lncrna part1更容易导致肿瘤转移和患者生存期缩短；但其临床意义和潜在机制尚未明确。
研究路线
细胞、cam和小鼠实验均表明part1水平与胃癌的恶性程度、转移能力呈负相关
rna-seq实验发现高表达的part1下调了pi3k-akt通路的一些基因，上调了肿瘤抑制基因plzf，肿瘤组织检测和tcga数据库资料确定了该结果
rna pull-down结合质谱鉴走技术首次发现了part1的潜在结合蛋白——ar(已有研究表明ar可以激活前列腺瘟中的plzf并抑制其增殖
rna pull down wb和 rip qpcr实验确定了part1与ar的相互作用
chip和双荧光素酶实验表明ar与plzf启动子的2个位点结合，plzf启动子因ar、part1的单独作用或两者的协同作用而激活
数据库调查和co-ip结果均显示pizf蛋白与ezh2蛋白结合
chip-qpcr结果表明pi3k-akt通路蛋白pdgfb的启动子与pizf、ezh2蛋白结合、且该区域发生h3k27me3修饰
功能回复实验表明， pdgfb过表达可以部分回复part1对gc细胞生长、迁移和侵袭、等能力的抑制
研究结论
lncrna part1是胃癌的肿瘤抑制因子，可以作为gc转移和预后的预测因子。新发现的part1作用机制是：part1与ar相互作用，以雄激素非依赖性的模式激活肿瘤抑制因子plzf，之后plzf蛋白和ezh2蛋白相互作用，导致pi3k-akt通路基因pdgfb的启动子发生h3k27me3修饰，从而使促癌基因pdgfb的转录活性受到抑制。
客户文献
han h. et al: long noncoding rna part1 restrains aggressive gastric cancer through the epigenetic silencing of pdgfb via the plzf-mediated recruitment of ezh2. oncogene. 2020. (if=9.867)