原位杂交检测-武汉思特进科技公司

杂交技术*重要的因素之一是选择*适的杂交反应温度。若反应温度低于tm 10～15℃，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少。若反应温度再低（tm-30℃），虽然互补链之间也可形成稳定的双链，但互补碱基配对减少，错配对增多、氢键结合的更弱。如两个同源性在50%左右或更低些的dna，调整杂交温度可使它们之间的杂交率变化10倍，因此在实验前必须首先确定杂交温度。通常有三种温度可供试验，即*适复性温度、苛刻复性温度及非苛刻复性温度。温度的选择及温度对杂交的影响见表18-3。
*适复性温度（optimunm renaturation temperature， tor）：tor =tm –25℃
苛刻复性温度：ts = tm – (10或15℃)
非苛刻复性温度：tns =tm – (30或35℃)
使用分支dna信号扩增的rna fish
invitrogen? viewrna?和primeflow?检测是使用分支dna信号扩增 (bdna) 来检测特异性信号的直接荧光rna ish方法。 使用*但兼容的信号扩增系统让rna靶标的多重复用成为可能。 荧光rna原位杂交检测分为四个主要步骤：样本制备、靶标杂交、信号扩增以及检测。 该方法可实现更高的特异性，更低的背景值和更高的信噪比。
在条件都得到满足的情况下，杂交的成败就取决于保温时间。时间短了，杂交反应不完成；时间长了也无益，会引起非特异结合增多。一般杂交反应要进行20h左右。1966年britten和kohne推荐用cot =值来计算杂交反应时间。cot 值实际上是杂交液中单链起始浓度（co）和 反应时间（t）的乘积。实验表明cot =100时，杂交反应基本完成。cot=0，原位杂交检测，基本上没有杂交。例如在液相杂交中未标记的dna 400μg/ml（按单股dna每微克 紫外吸收值为0.024计算，总的吸收值为 9.6），如果反应时间为21h，那么对于未标记的dna来说，cot =9.6/21 =100.8，杂交完成了。对标记dn a（浓度为0.1μg/ml）来说cot值为0.05，这就充分排除了标记dna的自我复性。tm值25℃时杂交*佳，所以首先要根据公式（4）计算杂交体tm 值。由此式可见，通过调节盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性。
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