293t细胞-英瀚斯(在线咨询)-细胞

细胞实验介绍——慢病毒建立稳转细胞系
慢病毒包装：公司使用3质粒慢病毒包装系统，慢病毒系统使用plko.1-egfp、pspax2、pmd2.g，过表达慢病毒系统使用plvx-acgfp、pspax2、pmd2.g三质粒系统，流式细胞技术，将质粒混匀后使用*钙转染方法转染至hek293t细胞中，培养48h后，收集上清。使用genecopo公司慢病毒颗粒纯化*盒将慢病毒纯化。纯化后留取部分检测病毒滴度，其余病毒冻存于-80℃冰箱中。
滴度检测：将病毒颗粒使用梯度稀释，分别293t细胞，72h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况。根据细胞荧光量计算病毒滴度。
细胞：在病毒*天对细胞进行计数，接种约10000个细胞于12孔板中，培养过夜后使用无培养基稀释病毒，加入12孔板中对细胞进行，病毒数量根据推荐细胞的moi加入（若无推荐moi，需做病毒梯度：1，5，10，50，100 5个梯度对细胞），6h后去除含病毒溶液，加入完全培养基细胞培养，培养48h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光强度。同时加入puromycin对细胞筛选，筛选约2周时间。细胞筛选好后，使用定量pcr和western blot检测目的*的稳定表达情况。
实验流程：慢病毒质粒构建-hek293t细胞培养-质粒转染293t细胞-病毒收集-病毒纯化-病毒滴度检测-细胞-稳转细胞筛选-稳转细胞鉴定
结果示例：
图 a 病毒滴度检测；b 目的细胞病毒效果图
软琼脂培养克l隆形成试验基本步骤:
(1)取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活l细胞计数，用含20%胎牛血l清的dmem培养液调整细胞密度至1x106细胞/l。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。
(2)用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40日中不会凝固。
(3)按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2xdmem培养基(含有2x和20%的小牛血l清)混合后，流式细胞实验，取3ml混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7~ 10ml)，293t细胞，冷却凝固，可作底层琼脂置co2温箱中备用。
(4)按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2xdmem培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2ml的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37回5%co2温箱中培养10~14天。
(5)把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞数。计算形成率。软琼脂培养法常用检测肿l瘤细胞和转化细胞系。试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超过40日。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，一般6cm的平皿接种1000个细胞。正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克l隆形成试验。
软琼脂集落形成率实验(软琼脂克l隆)
将1.2%低熔点琼脂糖与2x细胞培养基以1:1的体积比混合制备0.6%的底层琼脂，6孔板中每个孔1.4ml温室凝固，取对数期细胞，胰酶消化后吹散成单个细胞悬液，计数，并调细胞浓度为10000个/ml，将0.6%低熔点琼脂糖与2x细胞培养基以1:1的体积比混合，制备0.3%的上层琼脂，每孔加1ml 上层琼脂和100ul单细胞悬液(约1000ell/wel)， 混匀，室温凝固。置于37目，5%co2的细胞培养箱中培养2-3周，计数含50个细胞以上得克l隆，计算细胞集落形成率，spotll 采集图像。
小鼠成骨细胞和*骨细胞共培养模型的建立
细胞之间的相互调控作用奠定基础.方法利用24 h内新生小鼠颅骨和4~8周龄成年小鼠四肢长分别分离、培养成骨细胞和*骨细胞，细胞，采用间接接触的培养模式将接种了骨sui单核细胞的玻片或骨片置入提前24 h接种了成骨细胞的培养皿中进行共培养.共培养-定时间后进行* 骨细胞*酒石酸酸性*酶(tartrate-resistant acid phosphatase，trap染色鉴定和骨吸收功能检测，并进一 步采用rt- pcr对*骨细胞标志酶*基质金属蛋白酶.9(mmp-9)、trap 和组织蛋白酶k (cathepsin k )的表达进行检测结果共培养5天后可观trap( )多核细胞形成13天trap( )多核细胞数目达到高峰;骨吸收陷窝在共培养7天后开始出现，随着培养时间的延长，陷窝面积呈增加趋势;*骨细胞标志*trap在共培养3天时开始表达，而mmp-9和cathepsin k则在共培养5天后表达结论共培养体系中成骨细胞对*骨细胞调控作用显著诱导的*骨细胞具有噬骨能力，该共培养模型可用于成骨细胞和*骨细胞之间的相互调控作用研究.
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