南京英瀚斯(图)-*编辑技术-榆林细胞

关于细胞冻存的注意事项：
1. 为保持细胞大存活率，一般都采用慢冻存融的方法。
2. 冻存物距液氮面越近温度越低。标准的低冻速度为－1℃~12℃/ 分钟，当温度下降达－25℃时，下降速度可增至－5~－10℃/ 分钟，到－100℃时则可迅速冻入液氮中。因此要适当掌握冻存物下降入液氮中的速度，过快能影响细胞内水分透出，太慢则促冰晶形成。
3. 初次冻存者在下降冻存时，宜先用细木棒伸入罐中探测液面位置，然后需用温度计与冻存物并行的办法，以观测下降冻存物的速度、冻存物与液氮液面距离和温度三者关系，当已掌握以上各参数和冻存技术熟练后，仅按下降时间和下降距离便可获理想冻存效果。
细胞实验介绍——流式细胞术检测细胞周期和凋亡
流式细胞术检测细胞周期：
细胞周期：指细胞从*次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由g0/g1期、s期、g2期和m期组成。g0/g1期：有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，进入下一个细胞周期，或者进入静止期（g0期），而g0期从dna含量上无法与g1期区分，细胞开始rna和蛋白质的合成，但dna含量仍保持二倍体。s期：dna开始合成，细胞培养，细胞核内dna的含量介于g1期和g2期之间。g2期和m期：当dna成为4倍体时，细胞进入g2期。g2期细胞继续合成rna及蛋白质，直到进入m期。
pi法是经典的周期检测方法。pi为插入性核酸荧光染料，榆林细胞，能选择性的嵌入核酸dna和rna双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与dna的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的dna分布状态，从而计算出各个期的百分含量。
一般流程：细胞收集-70%酒精固定过夜-pi染色-流式细胞仪检测。
细胞凋亡：细胞凋亡的早期就有细胞膜表面*损发生。*损时凋亡细胞表面的磷脂腺丝氨酸(ps)可以从细胞内膜翻转至细胞的外膜。该过程发生在之前，检测ps的表达，能反映早期凋亡。annexinv是ca2 依赖的磷脂结合蛋白，对ps有很高的亲和性，并且可以与暴露于细胞外的ps相结合。利用这一原理，可以将annexinv标记荧光来识别早期的细胞凋亡。通常利用annexinv-fitc和碘化丙啶(pi)来区分凋亡和坏死细胞。pi的膜通透性很差，因而只能标记坏死的细胞。
一般流程：细胞收集-pi-annexinv标记-流式细胞仪检测。
结果示例：
图 a 细胞周期检测图；b 细胞凋亡检测图
二、脂质体转染操作步骤1、操作步骤 [方法一]：
(1) 细胞培养：取 6 孔培养板 (或用 35 mm 培养皿)，向每孔中加入 2 ml 含 1～2×105 个细胞培养液，37℃ co2 培养至 40%～60% 汇合时 (汇合过分，转染后不利筛选细胞)。
(2) 转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液 (为转染每一个孔细胞所用的量)a 液：用不含培养基稀释 1-10 μg dna，终量 100μl，b 液：用不含培养基稀释 2-50 μglr，*编辑技术，终量 100μl，轻轻混合 a、b 液，室温中置 10-15 分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染 (如出现沉淀可能因 lr 或 dna 浓度过高所致，应酌情减量)。
(3) 转染准备：用 2 ml 不含培养液*洗两次，293t细胞，再加入 1 ml 不含培养液。
(4) 转染：把 a/b 复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃ 温箱置 6～24 小时，吸除无转染液，换入正常培养液继续培养。
(5) 其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。
注意：转染时切勿加，对转染效率有很大影响。
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