高GC高保真酶-友名生物公司

低严格单链特异性引物pcr (lowstringencysingle specific primer pcr， lssp- pgr)技术
lssp - pcr是建立在pcr基础上的又一种新型*突变检测技术。要求是“二高一低”。高浓度的单链引物( 5-端/ 3-端引物均可).约4. 8lmol高浓度的taq酶( 16lmol/ 100ml) 低退火温度( 300.所用的模板必须是纯化的dna部分片段。在这种低严格条件下。引物与模板间发生不同程度的错配。形成多种大小不同的扩增产物。经电泳分离后形成不同的带型。对同一目的*而言。所形成的带型是固定的。因而称之为“*标签”。这是一种检测*突变或进行遗传鉴定的快速敏感方法。
反向pcr( inverse pcr， ipcr术
原理:反向pcr是克1隆已知序列旁侧序列的一种方法，主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化*组dna.后酶切片段自身环化.以环化的dna作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的dna的部分片段，大小取决于.上述限制性内切酶在已知基闲侧翼dna序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板dna，再通过反向pcr获得未知片段。
该方法的不足是:①需要从许多酶中选择限制酶，高gc高保真酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的dna部分片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶dna。②大多数有核*组含有大量中度和高度重复序列，而在yac或co*id中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向pcr得到的探针就有可能与多个*序列杂交。
巢式pcr(nest pcr枝术.
先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量.然后再用一对内引物扩增以得到特异的pcr带。此为巢式pcr。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式pcr。为减少 巢式pcr的操作步骤可将外引物设计得比内引物长些，且用量较少。同时在第yi次pcr时采用较高的退火温度而第二次采用较低的退火温度。这样在第yi次pcr时，由于较高退火温度下内引物不能与模板结合，故只有外引物扩增产物，经过若干次循环。待外引物基本消耗尽，无需取出第yi次pcr产物，只需降低退火即可直接进行pcr扩增。这不仅减少操作步骤。同时也降低了交叉污染的机会。这种pcr称中途进退式pcr( drop-in， drop-out pcr)上述三种方法主要用于少量dna模板的扩增。
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