永生化人脑微血管内皮细胞的培养步骤！

一．细胞简介：
细胞名称：永生化人脑微血管内皮细胞hcmec/d3（str鉴定）
人脑微血管内皮细胞是人微血管内皮细胞通过含端粒酶逆转录sv40t慢病毒转染得到。
二．细胞特性
1）来源：人脑微血管
2）形态：细胞呈梭状，细长型贴壁生长
3）含量：>1x106细胞数
4）规格：t25瓶或者1ml冻存管包装
5)用途：仅供科研使用。
三．细胞的培养步骤：
培养基及培养冻存条件准备：
1）准备内皮细胞培养体系包含：
内皮细胞培养基础培养基 93%
优质胎牛血清（fbs） 5%
内皮细胞培养添加剂 1%
青霉素/链霉素， p/s1%
2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3）冻存液：90%血清，10%dmso，现用现配。
四．细胞处理：
1）冻存细胞的复苏：
将含有1ml细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6ml完全培养基的离心管中混合均匀。在1000rpm条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
五．贴壁细胞传代可以参考以下方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的pbs润洗细胞1-2次。
2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mmedta于培养瓶中（t25瓶1-2ml，t75瓶2-3ml），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%fbs的培养基来终止消化。
3.轻轻打匀后吸出，在1000rpm条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2ml培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新t25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。
3）细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。
六．运输和保存
干冰运输及复苏好存活细胞
（1）1ml冻存管包装干冰运输，收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。
（2）t25瓶复苏的存活细胞常温发货，收到后按照细胞接收后的处理方法操作。
七．细胞接收后的处理
1）收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将t25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。
2）请在4或5x显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为时收到时细胞状态的依据。
3）贴壁细胞：细胞在37℃培养箱中放置2-3h，显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下，可去除培养瓶中灌液培养基（若有未贴壁的细胞需要离心回收，重悬打入到原培养瓶中）,加入新配制的完全培养基6-8ml，放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上，可以对细胞进行传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。
4）备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。收到细胞后第一次传代建议t25培养瓶1：2传代。