多通道检出用Real Time PCR仪-友名生物

la pcr的原理
la pcr的关键是具有3′→5′exonuclease活性 (proof re*g活性) 的耐热性dna聚合酶。在pcr过程中当有错误的碱基摄入时，反应性能将大幅度下降，takara ex taq 和takara la taq 依靠3′→5′exonuclease活性可将错配的碱基除去，从而延伸反应能顺利地进行下去，使长链dna的扩增成为可能。
hot start pcr的原理
hot start pcr法是提高pcr特异性的重要方法之一。这种方法可以防止在pcr反应第yi步骤因引物的错配或引物二聚体的形成而导致的非特异性扩增，从而可以提高目的dna部分片段的扩增效率。takara taq hot start version，takara ex taq hot start version，takara la taq hot start version，primestar hs dna polymerase，mightyamp dna polymerase是*1体和dna聚合酶的混合制品。*1体在高温加热前与聚合酶相结合，*聚合酶的活性。在pcr反应*初的dna变性步骤，多通道检出用real time pcr仪，*1体变性，聚合酶活性恢复。
pcr循环参数
预变性模板dna完全变性与pcr酶的完全激1活对pcr能否成功至关重要，建议加热时间参考*说明书，一般未修饰的taq酶激1活时间为两分钟。
变性步骤：循环中一般95℃，30秒足以使各种靶dna序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间。变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不*，易造成扩增失败。
引物退火：退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对pcr的特异性有较大影响。
引物延伸：引物延伸一般在72℃进行（taq酶*适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。
循环数：大多数pcr含25-35循环，过多易产生非特异扩增。
*后延伸在*后一个循环后，反应在72℃维持10-30分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。
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